células en suspensión
Tubos de ensayo
Pipetas
Crecimiento medio
hemocitómetro
cubierta slip in Hand conteo contador
Lente papel
azul tripán
Microscopio
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células
1 células remolino
suavemente para obtener una suspensión homogénea . Retirar un volumen de células , tales como 1,0 mililitro ( ml ) , con una pipeta y la transferencia en un tubo de ensayo . Diluir las células para dar 100.000 a 500.000 células por ml - esto debe proporcionar los aproximadamente 100 células requeridas para la significación estadística al contar
2 células
diluido, si es necesario , mediante la adición de 9,0 ml de medio a la . 1,0 ml de células . Mezclar y grabar la dilución . Si las células son todavía demasiado concentradas , eliminar 1,0 ml de células diluidas a un tubo nuevo , añadir 9,0 ml de medio , mezclar y grabar la dilución . Las células de mamíferos crecen generalmente en el intervalo de 100.000 a 5.000.000 por ml , por lo que de 0 a 2 diluciones deben ser suficientes .
3
Mezclar las células de la dilución final . Eliminación de un volumen pequeño , como por ejemplo 0,1 ml , y colocar en un tubo nuevo . Añadir un volumen igual de azul de tripano , mezclar y grabar la dilución . Las células muertas ocupan tripán azul y aparecerá azul bajo el microscopio.
Contando
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pulir el hemocitómetro y cubreobjetos con papel para lentes , y un lugar en la parrilla portaobjetos hemocytameter . Añadir una gota de células diluidas a la forma en V junto a la cuadrícula . Las células se mueven bajo el cubreobjetos por acción capilar.
5
Colocar el portaobjetos en el microscopio , se centran en la red y el uso recuento aguja del contador para contar las viables, no azules, células. Las células no deben solaparse ; si es demasiado densa , realizar otra dilución . Si las células se diluyen demasiado , preparar una muestra más concentrada.
6
Retire el hemocitómetro , limpio , volver a cargar , y contar de nuevo. Cuente cada muestra de células tres veces.
Cálculo
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Calcular el número de células por ml . La rejilla hemocitómetro se divide en 9 cuadrados grandes , cada uno con un volumen de 0,1 ml .
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Dividir el número de células contadas por el número de cuadrados grandes usados (nueve si se utiliza toda la red) , y se multiplica por 10.000 para obtener células por ml . Multiplicar por el factor de dilución ( s ) para la concentración final .
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registro de la fecha , de la muestra , los recuentos de células , factores de dilución y el número final de células por ml . Prepare una gráfica del número de células frente al tiempo de mostrar el crecimiento celular.