Protocolos Conjugación FITC

isotiocianato de fluoresceína , comúnmente conocida como FITC - se pronuncia " fit- c , " para rimar con " ditsy " - es un marcador fluorescente que se une químicamente , o conjugados , a otras moléculas como las proteínas y anticuerpos. Un anticuerpo conjugado con FITC también puede ser referido como un "anticuerpo marcado con FITC . " FITC es excitado por la luz a una longitud de onda de 488 nm y emite fluorescencia energía detectada a 530 nm. Un científico puede ver con un microscopio o el uso de equipo fluorescente que detecta las emisiones fluorescentes y las graba . Métodos

FITC conjugación sigue un protocolo básico . Por ejemplo , FITC y un anticuerpo se mezclan juntos en una cierta proporción en un tubo de ensayo y rotaron a temperatura ambiente durante una hora . Para quitar el FITC no unido de la solución , se vierte sobre una columna de cromatografía de afinidad - un tubo de vidrio lleno de un gel de cordón - como la que se unirá no conjugado con FITC . Mientras tanto , el anticuerpo marcado con FITC fluirá a través de la columna y se recoge para su uso.
Consideraciones

Antes de iniciar una conjugación, el investigador debe tener en cuenta varios puntos. En primer lugar, FITC es muy inestable y no se debe exponer a la luz - hay que tener en papel de aluminio que cubre los tubos en todo momento. En segundo lugar , el tiempo de conjugación y la temperatura pueden tener que ser alterado para una proteína sensible a la temperatura . Por último , diferentes proteínas y anticuerpos pueden tener diferentes capacidades de unión a FITC , por lo que encontrar la proporción correcta de anticuerpos con FITC es crítico ; demasiado poco FITC hace indetectable y un anticuerpo en exceso puede alterar su especificidad . Por esta razón , conjugaciones preliminares a pequeña escala en diferentes proporciones de FITC de anticuerpo se deben establecer en paralelo. Una vez establecida la relación óptima , la conjugación a gran escala se puede realizar.
Usos

médicos y los científicos utilizan marcados con FITC anticuerpos, hormonas y el crecimiento factores en una amplia variedad de ensayos y aplicaciones. Por ejemplo , una célula madre que se encuentran en la sangre tiene una molécula en su superficie llamada CD34 . Un técnico de laboratorio puede mezclar la sangre de un paciente con un anticuerpo marcado con FITC específico para CD34 , y ejecutar las células a través de un citómetro de flujo que utiliza un rayo láser para hacer la fluorescencia FITC . A continuación, el citómetro separa las células CD34 fluorescentes del resto de las células de la sangre , y los médicos pueden utilizar estas células madre aisladas para tratamientos terapéuticos .